重测序探索刚地弓形虫毒力相关基因

2016-01-27    编辑:诺禾致源
全基因组重测序:探索刚地弓形虫毒力相关基因banner图

安徽医科大学研究人员携手诺禾致源重测序团队,通过对2种刚地弓形虫的全基因组重测序变异检测研究,
从基因组水平解释了2种虫株产生表型差异的原因,为弓形虫病的治疗和疫苗研发提供了理论依据。
该研究成果发表于2015年10月的BMC Genomics杂志(IF: 3.986)。

研究背景

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii Nicolle&Manceaux, 1908)寄生于人和许多种动物的有核细胞,
但只能在猫科动物的肠道内繁衍,能够引起人畜共患的弓形虫病。与北美和欧洲群体遗传结构不同,Chinese 1 (ToxoDB#9)
是中国的弓形虫优势基因型。 在Chinese 1型弓形虫中,Wh3(强毒株)和Wh6(弱毒株)对小鼠表现出了不同的毒力。
本研究拟通过全基因组重测序技术,从基因组水平探究两种虫株表型及致病性差异的原因。

研究方法

取    材

强毒株Wh3虫株,弱毒株Wh6

建    库

500 bp文库

测    序

HiSeq 2000,PE125;测序深度:Wh3为63.91×,Wh6为63.61×

分    析

SNP、indel、CNV、SV的检测及注释;qRT-PCR分析

研究结果

 1 SNP、indel检测及注释

与参考基因组比对发现,Wh3中共有505,856个SNPs,30,004个indels;Wh6中共有505,654个SNPs,30,658个indels。进一步分析两样本特有变异,发现Wh3中特有SNP和indels分别位于2847和2452个基因中,Wh6中特有SNP和indels分别位于2,868和2,613个基因中(图1,图3)。

 2 CNV、SV检测及注释

与参考基因组比对发现,Wh3中共有2,320个SVs,1,942个CNVs;Wh6中共有4661个SVs,3,080个CNVs。其中,Wh3含有85个片段插入(总长度:282,700bp),2,995个片段缺失(总长度:4,940,000 bp);而Wh6含有90个片段插入(总长度:328,800bp),1,852个片段缺失(总长度:7,157,700 bp)(图2,图3)。

 3 毒力相关因子的变异信息分析

通过对与弓形虫毒力和侵染性相关的一系列关键因子(ROPs、GRAs、MICs、RONs和SAGs)的变异信息分析,发现与其他影响因子相比,GRA3和RON3的编码基因中含有更多的SNPs和indels;其中,GRA3编码基因含有35个SNPs和2个indels,RON3编码基因含有89个SNPs和6 个indels。 同时,与I、II和III型弓形虫相比,Chinese1型弓形虫的ROP16和GRA15表现为多态性的ROP16I/III和GRA15 II(图4)。

 4 qRT-PCR分析

为探究与Wh3和Wh6表型差异相关的基因,分别对Wh3、Wh6和RH这三种虫株进行qRT-PCR分析。与强毒株Wh3相比,发现在弱毒株Wh6中,GRA3和RON3的基因表达量显著上调,而ROM4, profilin, M2AP, AMA1, RON2, RON3和RON4的基因表达量显著下调。
与参考基因组虫株RH相比,在Wh3和Wh6中的SRS9, ROP8, MIC8RON5的基因表达量均上调,而SAG1, ROP5ROP18的基因表达量均下调(图5)。

SNPs、indels的对比分析及分布情况统计图

图1  SNPs、indels的对比分析及分布情况统计

注:a为SNP韦恩图;b为indels韦恩图;c为SNP突变型分布情况;d为编码区indels长度分布情况

CNVs(左)和SVs(右)的分布情况统计图

图2  CNVs(左)和SVs(右)的分布情况统计

Wh3(左)和Wh6(右)的全基因组变异情况图

图3  Wh3(左)和Wh6(右)的全基因组变异情况

I、II、III型弓形虫与Chinese 1型弓形虫的ROP16和GRA15序列比对分析图

图4  I、II、III型弓形虫与Chinese 1型弓形虫的ROP16和GRA15序列比对分析

三种弓形虫虫株的表达模式分析

图5  三种弓形虫虫株的表达模式分析

结论

通过对Wh3和Wh6两种虫株的全基因组重测序分析,发现与I型弓形虫参考基因组相比,
Chinese1型弓形虫中出现了大量的基因组结构变异。重测序及qRT-PCR分析,
发现有26个影响因子表现出显著差异,推测它们与弓形虫表型及致病性差异相关。

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