斑点雀鳝基因组解析

2017-03-10    编辑:诺禾致源
研究背景

为什么硬骨鱼类和人类基因组的连接较为困难?

• 两次的脊椎动物基因组复制(VGD)事件以及随后一些硬骨鱼类和四足动物之间ohnologs基因(来源于基因组复制的基因重复)的丢失;
• 硬骨鱼类基因组复制(TGD)事件导致了很多人类基因的重复;
• 快速的硬骨鱼类序列进化阻碍了同源基因的鉴定。

然而雀鳝却不存在这些问题。斑点雀鳝是在TGD事件之前与硬骨鱼类分歧进化的,未受到这一事件的影响,并且斑点雀鳝进化比较缓慢,许多整条的染色体和450万年前的四足动物仍保持着保守性。(图1)

图1 斑点雀鳝可作为连接脊椎动物的桥梁

研究方法

研究牺牲了一只野生成年雌性斑点雀鳝,分别建立了180bp、3kb、6~14kb等不同大小插入片段的文库,利用Illumina平台对斑点雀鳝进行全基因组测序分析,总测序深度达到90×。之后对雀鳝不同组织及发育阶段的胚胎进行了转录组分析,并与其他鱼类(斑马鱼、青鳉鱼)等进行了比较基因组分析,探究了雀鳝作为进化、医学等研究“桥梁”的可行性和实用性。


研究成果

1. 基因组图谱绘制

组装后的斑点雀鳝基因组大小约为945Mb,组装结果中contig N50:68.3 Kb,scaffold N50:6.9 Mb,并进一步定位到了染色体水平,共形成29个连锁群,包含94%的碱基序列。重复序列含量达到整个基因组的20%,共预测了39771个蛋白编码基因。

2. 斑点雀鳝基因组进化缓慢

比较基因组分析和转录组分析明确表明真骨鱼类单品系(雀鳝和弓鳍鱼)是硬骨鱼类的姐妹组,雀鳝体现出低速率的形态和表型进化,此外,真骨鱼类到软骨外类群的进化分支长度明显比其他骨脊椎动物要短。研究结果支持了一个假说:TGD时间可能促进了硬骨鱼类序列的快速进化。(图2)

图2 包含斑点雀鳝的系统进化树

3. 斑点雀鳝揭示脊椎动物核型的演变

斑点雀鳝代表第一个非四足动物、非硬骨鱼类有颚脊椎动物的染色体,能够实现大范围的基因序列分析而不受TGD事件的混杂影响。雀鳝核型(2n=58)同时包含大染色体和微型染色体。(图3,左上角)将斑点雀鳝染色体和人类、鸡、硬骨鱼类比对,突出了所有物种中同源片段的保守性差异(图3,上方右边两张图,下方左边两张图)。雀鳝和鸡的比对体现出很多整条染色体的保守性(图3,右上角),几乎一半的雀鳝核型在比对中体现接近一对一的关系,包括具有高度相关性染色体组装长度的微型染色体和大染色体(图3,左下角)。这些染色体大小和基因内容的相似性都证明了Ohno假说:斑点雀鳝和鸡的共有骨脊椎动物祖先同时具有大染色体和微型染色体。
斑点雀鳝的染色体还证实了另一假说:TGD事件之后(也可能是TGD事件导致的)硬骨鱼中染色体重排的数量增多。硬骨鱼中每一个TGD来源的基因对都和不止一条雀鳝染色体表现出保守共线性,说明TGD之前发生了重排(图3,下方中间图)。雀鳝和鸡共有很多整条的染色体,和硬骨鱼类却很少,这些结果说明,之前认为辐鳍鱼纲从总鳍分化出来后发生的染色体融合,实际发生在和雀鳝分化后的硬骨鱼类种,并且在TGD事件之后(图3,右下角)。这一发现解释了为什么斑点雀鳝没有发生TGD事件,却比典型硬骨鱼类的染色体多。

图3 斑点雀鳝保留了祖先的基因组结构

4. 斑点雀鳝揭示脊椎动物矿化组织、miRNA组的演变

脊椎动物都有矿化组织,但硬骨鱼和四足动物形成组织的分泌性钙结合磷酸蛋白(Scpp)基因差异和进化过程等仍存在争议。哺乳动物被认为含有最多数量的Scpp基因(如人类有23个),而硬骨鱼类只有两个,雀鳝中确定了35个Scpp基因。编码成釉蛋白(AMBN)、釉蛋白(Enam) 和釉原蛋白(Amel) 的釉基质蛋白基因在叶鳍脊椎动物发现,但在硬骨鱼类中没有,而后者缺少珐琅耐受性的牙齿,这些基因在雀鳝中都鉴定出来。(图4,左上角)尽管硬骨鱼和叶鳍脊椎动物分别丢失了Scpp基因,但雀鳝却保留了两个物种共有的特征。
此外,斑点雀鳝这一“桥梁”帮助确定了miRNA的同源性,例如,哺乳动物中的Mir425Mir191 基因之前认为在硬骨鱼中发生了丢失,实际是与其中的mir731mir462 基因分别同源(图4,右上角);哺乳动物中的Mir135B 基因和雀鳝中的mir135c 基因同源,和斑马鱼来源于TGD事件的mir135c-1mir135c-2 基因同源(图4,右下角)。

图4 斑点雀鳝帮助研究脊椎动物的蛋白编码基因和miRNA基因

5. 斑点雀鳝揭示出隐藏的顺式调控元件同源基因

CNE分析表明雀鳝中含有大多硬骨鱼类中没有的CNE,而这些通过人和硬骨鱼的直接比对是不能发现的。通过雀鳝这一“桥梁”,确定了29个人类启动子不能直接在硬骨鱼类中检测到,是否表示快速的进化分歧而不是确定的基因丢失(图5,上图),比对发现至少48%的启动子能够在硬骨鱼中比对到至少一个,因此雀鳝在很大程度上帮助人们了解脊椎动物四肢增强子的起源以及其在硬骨鱼类中的命运(图5,下图)。此外,研究发现硬骨鱼比雀鳝丢失了更多的四肢增强子,说明对于研究鳍到四肢的过渡,雀鳝相比于硬骨鱼可能是更好的模型。

图5 斑点雀鳝为脊椎动物调控元件的研究提供关联

此外,一种HoxD四肢增强子的功能性实验检测了雀鳝CNE桥梁的实用型。HoxD和HoxA分别在哺乳动物四肢基因表达的早期和晚期阶段。CNS39和CNS65在哺乳动物中激活早期的HoxD,通过雀鳝这一桥梁检测到了硬骨鱼中的CNS65(图6,上图)。为了研究隐藏的CNE同源基因是否还保留增强子功能,研究利用CNS65受体簇转基因到斑马鱼和小鼠。无论是雀鳝或斑马鱼中的CNS65都促进发育中斑马鱼胸鳍的早期表达(图6,中间图)。雀鳝中CNS65对小鼠前肢和后肢促进活性和小鼠的CNS65是几乎一致的,而斑马鱼CNS65的作用较弱。之后雀鳝CNS65模仿内源性小鼠增强子激活近端而不是远端四肢的基因表达(图6,下图)。这些功能实验表明HoxD在四肢或鳍中的早期表达的调节是来自同一个祖先。

图6 斑点雀鳝和硬骨鱼类早期HoxD增强子CNS65的确定和功能分析


参考文献

Braasch I, Gehrke AR, Smith JJ, et al. The spotted gar genome illuminates vertebrate evolution and facilitates human-teleost comparisons. Nat Genet. 2016, 3526.