不同引物对消除非目标DNA效率的影响

2017-01-19    编辑:诺禾致源
SNP概念

植物中包含真核细胞、原核细胞、以及叶绿体、线粒体等细胞器。不同的植物中,线粒体和叶绿体的数量也不尽相同。叶绿体DNA、线粒体DNA和细菌16S rDNA之间的序列同源性对于寻找合适的引物来研究植物内生微生物带来了挑战。


对于避免细胞器的污染,有三种可行的办法:
      1、改良现有的DNA提取方法,使之尽可能少的提取出细胞器DNA;
      2、研发一种阻断技术,阻止/降低真核宿主基因序列的扩增;
      3、利用特定的引物,扩增细菌16S rDNA同时又避免叶绿体DNA的扩增,其中,第三种方法最为常用。

下面以2016年发表在《Frontiersin Microbiology》(IF 4.165)文章“利用不同的引物研究杨树根系和根内微生物多样性”为例进行详细的阐述。


内容简介

本文选择了7对不同序列的引物,分别以杨树根际土壤、根、茎和叶的基因组序列为模版进行扩增,比较不同的引物扩增下叶绿体和线粒体的污染情况及微生物组成情况,为寻找避免叶绿体和线粒体的污染提供理论依据。本研究为植物微生物避免叶绿体的污染及开发适合新平台引物提供了理论依据。

研究结果

利用不同的引物研究杨树根际土壤微生物,一些引物能有效降低检测到的叶绿体DNA的含量(967F-1391R:<0.1%,341F-785R:0.1%,341F-783Rabc:<0.1%)和线粒体(799F-1193R<0.1%)。检测到线粒体、质粒或许与植物组织的腐烂、组织内含有真核微生物有关。

利用不同的引物研究杨树组织中的微生物,不同的引物所呈现的结果差别甚大。特定的引物能有效降低叶绿体DNA的污染,例如:引物799F-1391R和799F-1193R能完全消除茎、叶内叶绿体的污染,341F-783Rabc不能有效的避免叶绿体的污染。

杨树叶片的叶绿体DNA,利用不同的引物进行qPCR扩增。799F-1391R和799F-1193R对叶绿体DNA亲和力较低,分别为9.2%和17.4%。其他测序引物对叶绿体DNA的亲和力较高(图1)。

图1 不同引物叶绿体DNA扩增效率比较



选择与叶绿体DNA低亲和的三对引物(799F-1391R、799F-1193R、341F-783Rabc)的测序结果进行注释及比较分析,在根际土壤中,三对引物得到的平均OTUs数目分别为277、236、270。在根部,799F-1391R所得OTU数目最多,达115。799F-1193R和341F-783Rabc分别得到79和87个OTU(图2)。


说明:在门水平上,根际土壤中,三对引物鉴定到的主要菌群是变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门;根内主要菌群是变形菌门、拟杆菌门;在茎内,引物341F-783Rabc得到的变形菌门远远高于其他两对引物,这显然与前者测序得到的数据量少有关;叶片中,变形菌门占优势(图3、4)。

图2 不同引物序列测序注释结果覆盖度
(左上)799F-1391R (右上) 799F-1193R (下) 341F-783Rabc

图3 不同引物序列测序注释结果α多样性分析
从上到下依次对应土壤、根、茎、叶,均一化reads数为417,
nd为由于序列数目太少而不确定的结果

图4 不同引物扩增的植物不同部位门水平上相对丰度柱形图
从左上到右下依次为根际土壤、根、茎、叶,变形菌门分类到了四个
亚型(alpha,beta,gamma,delta)



在门水平上,根际土壤中,三对引物鉴定到的主要菌群是变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门;根内主要菌群是变形菌门、拟杆菌门;在茎内,引物341F-783Rabc得到的变形菌门远远高于其他两对引物,这显然与前者测序得到的数据量少有关;叶片中,变形菌门占优势。


研究结论

不同的引物对于消除非目标DNA具有不同的效率,本研究选用的7对引物中,799F-1391R、799F-1193R能有效消除叶绿体的污染,且α多样性相对较高,物种丰度最大,适用于根际和内生菌的研究。其原理是利用在引物设计时,799F这一正向引物,只能特定的识别细菌的16Sr DNA序列,而与叶绿体DNA不能匹配,从而有效避免叶绿体DNA的污染。


延伸

现在使用最为广范的平台Illumina HiSeq和MiSeq读长的限制,799F-1391R这对引物似乎并不适用,799F-1193R这对引物,尽管α多样性略低于799F-1391R,但这与本文数据量不够有关,或许更高深度的测序能有效解决这一问题,更好的还原植物内生微生物的菌群结构。

参考文献

Beckers B., Beeck M. O. D., Thijs S., et al. Performance of 16s rDNA Primer Pairs in the Study of Rhizosphere and Endosphere Bacterial Microbiomes in Metabarcoding Studies. Frontiers in Microbiology,2016.