MeRIP-seq

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经典案例

案例一 m6A RNA 甲基化酶 METTL3 通过依赖 YTHDF2 的转录后抑制 SOCS2 促进肝癌的发展

RNA N6-methyladenosine methyltransferase-like 3 promotes liver cancer progression through YTHDF2-dependent posttranscriptional silencing of SOCS2
common gene regulatory principles and new control modules

期刊: Hepatology
影响因子:13.246
发表单位:香港大学
发表年份:2018年6月

研究背景

报道称 METTL3 通过一种独立于其甲基转移酶活性的机制促进肺癌细胞中癌基因的蛋白质翻译,但 METTL3 是否能通过 m6A 甲基转移酶依赖性的表观遗传,沉默人类癌症中的抑癌基因仍待阐明。在本研究中,作者通过深入研究METTL3 失调在人肝细胞癌(HCC)中的作用,探索了人类恶性肿瘤中一个独特的层面——表观遗传改变。研究METTL3 在肿瘤进展中的作用,可能借鉴于未来的临床癌症治疗和药物开发。

方法流程

取材

HCC 细胞系 Huh-7 和 HepG2 细胞及其稳定遗传的 METTL3 基因敲除株

建库

提取总 RNA,富集 mRNA,打断,用 m6A 抗体进行 IP,构建 MeRIP-seq 文库。

测序

Illumina HiSeq 2000,PE100

信息分析

序列比对可视化分析、Peak calling、与基因表达水平关联分析。

研究结果

1. 通过对 MeRIP-seq 和 RNA-seq 数据的联合分析作者发现 SOCS2 可作为 METTL3 介导的 m6A 修饰的下游靶基因。

2. METTL3 通过 m6A 阅读器 YTHDF2 依赖的通路抑制 SOCS2 的 mRNA 稳定性

通过 MeRIP-qPCR 证实 SOCS2 的 mRNA 受到 METTL3 的 m6A 修饰调控。为了探究 m6A 修饰是如何影响 SOCS2 表达的,作者构建了野生型和突变型 SOCS 报告 mini 基因。对于突变报告 mini 基因而言,m6A 的保守序列(比如RRACH)中 A 被替换成 C,从而消除 m6A 修饰。作者发现突变了 SOCS2 后显著增加了 SOCS2 的表达,通过比对荧光活性,还发现在野生型的 SOCS2 融合人报告基因的荧光强度在沉默 METTL3 后被显著放大。然而,敲低 METTL3 对突变型的 SOCS2 融合报告基因没有影响。以上结果表明 SOCS2 的表达水平是由 METTL3 的 m6A 修饰调控的。另外,从测序结果中作者发现 YTHDF2 结合位点与 m6A 修饰位点很接近。因此作者敲低 YTHDF2,结果发现 SOCS2 表达显著上调。上述结果都再次证实 METTL3 通过 m6A 阅读器 YTHDF2 依赖的通路抑制 SOCS2 的 mRNA 稳定性。

研究结论

METTL3 在人类 HCC 中经常上调并有助于 HCC 进展。METTL3 通过m6A-YTHDF2 依赖性机制抑制 HCC 中的 SOCS2 表达。表明了肝脏癌发生中表观遗传改变的重要机制。

参考文献

Chen M, Wei L, Law C, et al. RNA N6‐methyladenosine methyltransferase‐like 3 promotes liver cancer progression through YTHDF2‐dependent posttranscriptional silencing of SOCS2[J]. Hepatology, 2018, 67.

案例二 m6A mRNA甲基化在生理状态和2型糖尿病中调节人β细胞生物学

m6A mRNA methylation regulates human β-cell biology in physiological states and in type 2 diabetes

期刊: Nature Metabolism
影响因子:暂无
发表单位:Chicago University & Harvard University
发表年份:2019年7月

研究背景

糖代谢紊乱是二型糖尿病(T2D)病发的主要诱因之一。在糖代谢稳态中,胰岛细胞—尤其是 β-细胞的分子生物学调控起到了关键的作用。近年的研究发现 RNA 上的 m6A 甲基化修饰通过调节 mRNA 的定位、稳定性、以及翻译效率等通路参与调控了众多生物学过程。而对于 m6A 是否参与了胰岛细胞的生物学功能调控及其机制的研究尚属空白。

方法流程

取材

7名 T2D 患者和8名健康人群胰岛,EndoC-βH1 细胞和小鼠胰岛

建库

提取总 RNA,富集 mRNA,打断,用抗 m6A 多克隆抗体进行 IP,构建 MeRIP-seq 文库。

测序

Illumina HiSeq 4000,SE50

分析

Peak Calling、差异甲基化分析、peak 相关基因的富集分析

研究结果

1. 提出假说:m6A 在关键基因上的甲基化下调, Insulin/IGF1-AKT-PDX1 信号转导通路的激活,继而导致细胞周期停滞并损害胰岛素分泌。

为了探索 m6A 甲基化参与调控糖尿病人胰岛细胞的分子机制,研究人员对糖尿病人及对照人群胰岛组织进行了转录组
测序和 MeRIP-seq。利用该胰岛 m6A 甲基化图谱,通过单细胞转录组数据计算的细胞水平基因表达可变性分析,发现
在糖尿病人中 m6A 标记的基因比对照人群具有更高的表达水平;而非甲基化基因则没有显示出病人组和对照组的基因
表达差异。研究人员进一步分析发现了 m6A 差异甲基化的基因富集在胰岛素调控和糖尿病相关代谢通路,其中,多个
Insulin/IGF1-AKT-PDX1 信号转导通路上的基因出现了甲基化的下调。Insulin/IGF1-AKT-PDX1 是跟糖尿病高度相关
的信号通路,AKT 除了可以促进细胞的存活及生长外,还能促进下游基因 Pdx1 的稳定性。而 Pdx1 基因则可调控 β 细
胞的细胞属性、细胞周期以及胰岛素的分泌。

2. 验证假说:m6A 通过调控 Insulin/IGF1-AKT-PDX1 信号基因的表达实现对胰岛 β 细胞周期和胰岛素分泌的调节。

研究人员利用 shRNA 在 β 细胞 EndoC-βH1 上敲除了甲基转移酶 Mettl3 以及 Mettl14 ,并观察到细胞周期停滞、基础
胰岛素分泌上升、葡萄糖刺激胰岛素分泌受损等表型。分子实验进一步表明 AKT 通路的激活受甲基转移酶的影响。同时
PDX1 蛋白水平受其甲基化水平降低和 AKT 激活降低的共同影响而下调。

3. Mettl14 敲除的小鼠模型进一步证实 m6A 甲基化在糖尿病胰岛中的调控作用

研究人员利用胰岛 β 细胞中特异性 Mettl14 敲除的小鼠模型,进一步验证了 m6A 甲基化在糖尿病胰岛中的调控作用。
Mettl14 敲除的小鼠在一个月时开始表现出血糖升高,并在3个月时加剧。组织切片荧光染色显示,在大约两个月时,小
鼠开始出现 β 细胞减少;表达 Pdx1 基因(β细胞身份的标记基因)和胰岛素的细胞相应减少。小鼠 β 细胞转录组数据
表明,Mettl14 敲除小鼠中多个细胞周期基因下调,与前述细胞周期停滞的表型一致。同时多个 β 细胞早期发育标记基
因上调,而诸如 Pdx1, Mafa, Ucn3 等成熟 β 细胞标记基因则出现下调。磷酸化芯片检测数据显示 Akt 信号通路多个基因
Mettl14 敲除小鼠的 β 细胞中受到抑制。这些结果表明了血糖升高是由于葡萄糖刺激胰岛素分泌受损而非胰岛素不敏 感导致小鼠出现血糖不耐受。

研究结论

该研究通过模式细胞和模式动物实验,证实了由 m6A 调控 Insulin/IGF1-AKT-PDX1 信号转导通路进而影响细胞周期及胰岛素分泌,并且胰岛 m6A 甲基化组相较于转录组可更好的作为糖尿病分子标记。

参考文献

Jesus DF.D, Zhang Z, Kahroman S, et al. m6A mRNA methylation regulates human β-cell biology in physiological states and in type 2 diabetes[J]. Nature Metabolism, 2019.

案例三 番茄成熟过程中 m6A mRNA 甲基化介导调控 DNA 脱甲基酶 SlDML2

RNA methylomes reveal the m6A-mediated regulation of DNA demethylase gene SlDML2 in tomato fruit ripening

期刊: Genome Biology
影响因子:14.028
发表单位:中国科学院植物研究所
发表年份:2019年8月

研究背景

一直以来,DNA 的 5mC 修饰和 mRNA 的 m6A 修饰在基因的表达调控中扮演着重要角色,其中 DNA 的 5mC 修饰作为一种比较保守的表观修饰,在许多基础生物过程中都起到了关键的调控作用。如本研究关注的果实的成熟过 程,与 DNA 的 5mC 修饰就有着密切的关联。已有研究表明,在番茄中突变 DNA 的脱甲基酶基因 SlDML2 会引起全基 因组范围内的超甲基化,并显著抑制果实的成熟。但是这个过程中 m6A 的作用及 5mC 和 m6A 之间的关联性还不为所 知。而已知拟南芥中,RNA 脱甲基酶 SlALKBH2 介导的 m6A 修饰可调控 DNA 脱甲基酶的同源基因 SlDML2

方法流程

取材

植株:对照组、Cnr(colorless non-ripening)突变株、RNA 去甲基酶突变株(slalkbh2 mutants);取样时间:开花后 17、39、42、47和52天收获的果实:Immature green (IM), mature green (MG), breaker (Br),orange ripe (OR) and red ripe (RR)。

建库

提取总 RNA,富集 mRNA,打断,用抗 m6A 多克隆抗体进行 IP,构建 MeRIP-seq 文库。

测序

Illumina HiSeq X,PE150

分析

Peak Calling、差异甲基化分析、peak 相关基因的富集分析

研究结果

1. m6A 修饰在果实成熟过程中展现出动态变化趋势,m6A 整体水平随着果实成熟而逐渐下降,与 DNA 甲基化类似;在成熟缺陷突变体 Cnr 中,伴随着 DNA 超甲基化,m6A 整体水平也更高。

2. m6A 修饰普遍存在于番茄果实 mRNA 中,且 m6A 修饰与基因转录水平呈负相关。

果实成熟过程和 Cnr 突变体中 m6A 整体水平的变化与 m6A 去甲基化酶基因 SlALKBH2 的表达有关; SlALKBH2 受 DNA 甲基化调控。m6A 去甲基化 酶 SlALKBH2 能够结合 DNA 去甲基化酶基因 SlDML2 的 mRNA,调节其 m6A 修饰及稳定性; SlALKBH2 基因突变后 SlDML2 的 m6A 水平升高,mRNA 含量降低,果实不能正常成熟。

研究结论

该研究初步明确了 DNA 甲基化与 RNA 甲基化之间存在关联性,揭示了果实成熟调控的新机制,为阐明果实成熟调控网络提供了新思路。鉴于 DNA 甲基化和 RNA 甲基化的多重功能,该研究中所呈现的反馈调控机制也适用于其他生物学过程。

参考文献

Zhou LL, Tian SP , Qin GZ. RNA methylomes reveal the m6A-mediated regulation of DNA demethylase gene SlDML2 in tomato fruit ripening [J]. Genome Biology, 2019.