血液循环肿瘤细胞DNA中突变等位基因的定量分析与肺癌生存期的相关性研究

2017-01-10    编辑:诺禾致源

研究背景

众所周知,利用组织活检方法来发掘肿瘤耐药性产生的分子机制会面临很大挑战,
目前已有多篇研究提出ctDNA检测EGFR 突变的可行性,但多是定性检测,并非动态的定量评估。
本篇研究选取了常用定量检测方法中的ddPCR以及目标区域测序,
评估它们在检测ctDNA突变时的一致性和可行性。

流程方法

  • 3例晚期肺腺癌患者:肿瘤组织/正常血浆、EGFR-TKI治疗前/后血浆
  • 文库构建:NEBNext DNA Library Prep Reagent Set
    目标区域捕获:Agilent Custom SureSelect Kit(483 Panel)
  • Illumina HiSeq 2500
    PE150
  • 1.生存曲线分析
    2.高频突变基因统计及通路富集

研究结果

ddPCR检测EGFR 基因突变,发现患者ctDNA与相应肿瘤组织突变一致率可达74%。ctDNA中含有EGFR 基因突变患者无进展生存期(Progression-free Survival,PFS)和总生存期(Overall survival,OS)高于ctDNA EGFR 野生型患者。且EGFR 基因突变丰度越高(>5.15%),其PFS和OS越长。对患者的ctDNA进行目标区域测序发现66.6%的患者治疗后ctDNA中总突变数增加,76.5%的患者治疗后ctDNA共有突变频率增加。


1. EGFR 基因突变与患者PFS和OS关联分析

TKI治疗前患者ctDNA中含有的EGFR 基因突变比ctDNA中不含有EGFR 基因突变患者PFS、OS长。且EGFR 基因突变丰度越高(>5.15%),其PFS和OS越长(图1)。


2. 高频突变基因统计及通路富集分析

利用483panel对12例患者治疗前和治疗后的ctDNA进行高深度目标区域测序。发现治疗前ctDNA中主要是EGFR 基因其他类型的突变,例如L858R突变,并无T709M突变。但是治疗后EGFR T790M突变占50%(图2)。还发现了其他的突变基因例如TP53PTENMLL2 等,主要富集在细胞周期通路和TGF-β信号通路中。


3. 治疗前后ctDNA中SNVs和InDels突变情况分析

利用目标区域测序研究患者治疗前后ctDNA中的SNVs和InDels的变化情况。结果发现66.6%的患者治疗后ctDNA中总突变数增加。76.5%的患者治疗后ctDNA共有突变频率增加。


4.ddPCR与NGS用于ctDNA中 EGFR 基因突变检测的比较

ddPCR检测极限是0.04%而NGS检测极限是5%,但是对于同一个检测样本来说,两种检测方法对于EGFR 基因突变丰度变化的检出趋势高度一致,说明了两种方法在ctDNA中检测EGFR 基因突变是可行的。

图1 ctDNA中EGFR 基因突变情况与患者PFS和OS关联分析


图2 高频突变基因展示图

研究结果

利用ddPCR来定量和定性分析经EGFR-TKI治疗前后患者体内ctDNA中EGFR 基因突变的情况,
并且结合临床数据全面分析了患者生存周期与EGFR 基因突变之间的关系。
将ddPCR检测方法与二代测序技术相结合,
在精准定量EGFR基因突变丰度的同时还可以发现更多的新型或不常见的突变基因,
为肺腺癌的个体化治疗提供了指导。