全基因组扩增技术

2017-03-10    编辑:诺禾致源

有研究表明,每个细胞都是独一无二的,即使来源相同的单个细胞,
由于随机生物过程和环境扰动的原因,
彼此在许多方面也存在差异。二代测序技术是为细胞群体设计的,
所需要的样品量为mg级,而单细胞中的DNA(大约只有6 pg DNA)是无法满足测序的样品量,
所以无法满足科研工作者对单细胞研究的需求。
为了使少量样品满足测序的要求,全基因组扩增技术(WGA)横空出世。

WGA技术

技术原理

1. DOP-PCR扩增

DOP-PCR扩增(Degenerate Oligonucleotide Primed PCR):使用简并配对引物,即类脱氧肌苷引物,它可以结合到DNA任何部位。引物的3’端为6bp退化寡核苷酸,5’端为正常的碱基。3’端和DNA链随机结合,最初几个循环退火温度要低(30℃左右),然后延伸直到5’端引物配对处。特点是扩增均一性差和片段长度不定(图1)。

2. MDA扩增

MDA扩增(Multiple Displancement Amplification):使用多种引物六聚体和φ29DNA聚合酶。引物六聚体是由6个随机核苷酸组成的;而φ29DNA聚合酶是一种高保真聚合酶,具有3‘到5’外切酶校读能力,并且具有特殊的多重置换和连续合成特性。特点是扩增长度50-100bp,指数扩增,存在扩增偏倚性(图2)。

3. MALBAC技术

MALBAC技术(multiple annealing and looping-based amplification cycles):利用φ29聚合酶的前链移开功能,以原始基因组为模版进行复制,其扩增产物具有完整的末端,因此可以发生环化,不被复制,保证了线性扩增以降低扩增偏倚性,同时有较高的扩增效率(图3)。

扩增效果

标红的为LWGS效果较好的组,在这四组中进行比较得知:
1、检测覆盖度,MDA和MALBAC效果优于DOP。
2、在灵敏度方面:四种试剂WGS,发现MDA-2和MALBAC效果较好,MDA基因组回收灵敏度最高。
3、检测SNV和CNV, MDA-2和MALBAC检测率和准确性高,MDA存在扩增偏好性,MALBAC 扩增偏好性低,均一性,覆盖度比MDA高,
但MDA-2成本相对较低。

参考文献

[1] Hou Y, Wu K, Shi X, Comparison of variations detection between whole-genome amplification methods used in single-cell resequencing. Gigaxcience. 2015, 4:37.
[2] Huang L, Ma F, Chapman A. Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology an Applications. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015, 16:79-102.