环状RNA验证

2017-03-10    编辑:诺禾致源

环状RNA(circRNA)是一类具有闭合环状结构的非编码RNA,
其闭环结构可以逃逸RNA酶的降解,因此比线性RNA更稳定。
已有的研究表明,circRNA在脑发育神经细胞分化、精神疾病(如阿尔茨海默症)、
肿瘤发生与发展中均发挥重要作用。
作为非编码RNA新宠,人们对其一探究竟的热情持续高涨,
利用高效的二代测序手段可快速获得circRNA种类、表达丰度、生物学功能等信息。
circRNA到底发挥哪些作用?想要得到结论,还要回到传统实验中进行验证。

一、circRNA序列及定量验证

1.1 circRNA定量验证

验证方法通常采用qPCR法。但是circRNA引物设计相比线性RNA比较麻烦。

1.2 结论

circRNA鉴定时,根据测序reads同时比对到外显子B和D的情况,推测该基因可能发生环化;同时,根据junction位点碱基特点对发生环化的外显子向两侧延伸,确认其符合两侧分别是GT/AG的特点(当然,GT、AG并不在circRNA序列中),判断该基因产生的为circRNA。拿到鉴定好的circRNA序列之后,秉承扩增产物越短越好并跨越junction 位点的原则(增强back splice site扩增效率),设计divergent primers,扩增产物为图2上方黄色片段。

2.1 Northern blot验证circRNA序列

Northern blot方法是验证RNA序列既传统又高效的方法,需要注意的是探针的设计是事关杂交实验成败的关键因素,对于exon环化circRNA,设计的探针要求跨越back splice junction位点;对于含内含子环化circRNA,除了跨backsplice junction 位点设计 探针外,还可在内含子区域设计探针。

2.2 验证实验

A、对total RNA去DNA、去rRNA、去线性RNA(RNAse R/H消化)处理,与探针杂交;
B、Total RNA与探针杂交;
C、基因组DNA与探针杂交
以上A、B、C同时进行,共同验证。

3. circRNA是否存在?

通过电泳实验可以实现,提取total RNA分成两份,一份同时去rRNA去线性RNA,一份不做处理,分别进行电泳,对比两者可发现前者还可以看到电泳条带。另外,circRNA要比同等长度的线性RNA跑的慢,所以根据二代测序鉴定出的circRNA长度观察电泳结果,如果条带落后于相应marker,也可以初步判断目标circRNA的存在。

二、circRNA功能验证

1.1 circRNA研究较晚,目前发现的主要功能

A. 发挥海绵效应(sponge)吸附miRNA。
B. 与RNA结合蛋白(RBP)结合,形成复合物,调控RNA的转录。
另外,circRNA表达具有很强的组织特异性和保守性。


1.2 验证实验

(1) 验证circRNA表达的组织特异性
原位杂交(Situ Hybridization)设计杂交探针,探针同样要跨back splice site,可以很清楚的看到circRNA在哪些组织中表达很高,作为组织特性判断的依据(图3)。


(2) 过表达——正向验证
circRNA在体外不能成环,circRNA过表达的原理主要是基于circRNA的成环机理。circRNA的成环基于circRNA侧翼序列的碱基互补配对(互补序称为Alu结构)。基于circRNA侧翼Alu序列特征,PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列(注意扩增的模板就是DNA),随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切,进而连接载体,转染进对应细胞样本。设计引物扩增产物后进行片段回收,通过sanger测序验证转染效率,或构建共表达载体(带GFP标签)通过荧光判断转染效率,最后利用divergent primer验证circRNA过表达情况。
过表达建议:扩增包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列的目标区域。有研究表明侧翼上下游1kb处过表达效果更明显。


(3)基因沉默——反向验证
通过siRNA干扰封闭circRNA的功能(图4)。针对外显子环化circRNA,可在back splice junction位点前后设计siRNA;针对内含子环化circRNA,除了back splice junction位点前后序列设计siRNA以外,也可针对内含子序列设计siRNA;每个siRNA设计对应对照,对照siRNA设计要求:back splice junction 位点一端互补配对,另一端错配(阴性对照)。


参考文献

[1] Li Z, Huang C, Bao C,et al. Exon-introncircular RNAs regulate transcription in the nucleus.Nat Struct Mol Biol. 2015, 22(3):256-64.
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