WGS全基因组脱靶检测

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经典案例

案例一 非靶标 DNA 裂解的高通量分析揭示了 RNA 编程的 Cas9 核酸酶的特异性

High-throughput profiling of off-target DNA

文章杂志:Nature Biotechnology
影响因子:32.182
文章单位:哈佛大学化学系化学生物学和霍华德休斯医学研究所
发表年份:2013年

一、研究背景

CRISPR/Cas9 是一种来源于细菌获得性免疫的由 RNA 指导 Cas9 蛋白对靶向基因进行修饰的技术。CRISPR/Cas9 与靶位点识别的特异性主要依赖于 gRNA 靠近 PAM 处10~12 bp 碱基的配对

二、技术路线

gRNA 设计

CLTA 基因的四个不同靶位点
每个设计2条共8条 gRNA。

体外文库构建

每个 DNA 底物文库包含1012个潜在的
脱靶 DNA 序列,进行高通量测序。

数据分析

1. 不同长度 gRNA 活性比较
2. 脱靶效率
3. CRISPR/Cas9 的特异性与
gRNA 序列中的种子序列长度关系

三、研究结果

1. CLTA 基因的4个靶位都存在脱靶现象 该研究对 CLTA 基因的4个不同靶位点设计8条不同序列的 gRNA,8个 gRNA:Cas9复合物,可裂解1012个潜在的脱靶 DNA 序列,通过体外筛选与高通量测序,发现4个靶位点均存在脱靶现 象,脱靶效率最高可达84%。

2. CRISPR/Cas9 的特异性低 以前的研究结果对比,本研究得出 CRISPR/Cas9 的特异性仅与 gRNA 配对的靠近PAM 处7~12 bp 碱基相关。

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3. 在体外和细胞中 gRNA 的活性和特异性 该研究在体外选择中检测了两种长度不同 gRNA 结构,发现长度短的 gRNA 比长度长的 gRNA 特异性更高,而活性却较低。虽然 gRNA:Cas9 混合物浓度的提高会提高 Cas9 的切割活性,但是进一步降低了 gRNA:Cas9 混合物打靶的准确性,包括会在 PAM 附近引起突变,从而增

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四、研究结论

该研究揭示了 Cas9 能够导向其编程靶向的 DNA 序列的精确度,与 sgRNA 结构在 DNA裂解特异性中的未知作用。本研究揭示的原理可能也适用于基于 Cas9 的效应子,这些效应子被设计用于介导 DNA 分裂以外的调节功能。

案例二 在水稻中能产生全基因组脱靶突变的是胞嘧啶碱基编辑器而非腺嘌呤碱基编辑器

Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice

文章杂志:Science
影响因子:41.058
文章单位:中国科学院遗传发育所高彩霞课题组
发表年份:2019年

一、研究背景

单核苷酸变化是人类疾病和经济作物性状变异的重要原因。不管是 CRISPR/Cas9 还是 CRISPR/Cpf1 基因组编辑技术,都是可以通过 DNA 片段的插入或删除来调节基因的功能,难以有效地修正单个核苷酸。目前已开发出的胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)是将切口酶型 Cas9 蛋白(nCas9)与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶融合在一起形成的,并且发现它们在单向导 RNA(sgRNA)的靶位点中促进 C>T 或 A>G 转化。脱靶效应一直是基因编辑比较重要的因素,而且这两类编辑器的脱靶效应并未在全基因组水平上

二、技术路线

编辑器选择

选择3种剪辑编辑器:BE3、
高保真 BE3、ABE

测序方法

45株编辑植株,11株不带有
sgRNA 的转化植株,
9株对照植株进行全基因组测序,
测序深度60×。

数据分析

不同碱基编辑器转化植株及对照组的
全基因组突变类型(SNV、indel)

三、研究结果

1. BE3 组、HF1-BE3 组和 ABE 组和对照组产生 indel 数量上没有显著差异。在有没有 sgRNA 的情况 BE3 组和 HF1-BE3 组都在水稻基因组中造成大量的单核苷酸变异(SNVs),且大部分为 C>T 类型的碱基突变。
2. 这些脱靶突变,主要是 C> T 类型,并且在转录的基因区域中富集,同时这些突变又不能通过目前脱靶软件(Cas-OFFinder)预测到。
3. ABE 系统表现出非常高的特异性。ABE 处理的植株与对照植株在全基因组范围内的 SNVs 数量基本一致。
综上,该研究表明现有 BE3 和 HF1-BE3 系统,而非 ABE 系统,可在植物体内造成难以预测的脱靶突变,因此,需要进一步优化提高其特异性。

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四、研究结论

1. 首次在体内利用全基因组测序技术全面分析和比较了这三种单碱基编辑系统在基因组水平上的脱靶效应。
2. 选用了 BE3、HF1-BE3 或 ABE 编辑和只用编辑器转化没有 sgRNA 的 T0植物和9个经历转化过程但没有 T-DNA 整合的植物,以及12个野生型植物过滤掉背景。
3. 该研究明确了不同单碱基编辑工具的脱靶特性,对单碱基编辑工具的应用和选择具有重要的指导意义。

参考文献

[1] Pattanayak V, Lin S, Guilinger J P, et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity[J].Nature Biotechnology, 2013, 31(9):839-843.
[2] Jin S, Zong Y, Gao Q, et al. Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice[J]. Science, 2019, 364(6437):292-295.